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可用于設(shè)計(jì)用戶定義的分子生成生物傳感器，為廣泛的生物應(yīng)用提供檢測(cè)工具。此研究利用了一種名為PYR1的植物脫落酸受體，該受體具有可塑的配體結(jié)合口袋和配體誘導(dǎo)的異二聚化要求，從而有助于構(gòu)建有意義的響應(yīng)函數(shù)。
通過(guò)這種平臺(tái)，我們成功開(kāi)發(fā)了21種傳感器，它們對(duì)一系列小分子具有納摩爾到微摩爾的靈敏度，包括結(jié)構(gòu)多樣的天然和合成大麻素以及幾種有機(jī)磷酸鹽。通過(guò)X射線晶體學(xué)分析，我們揭示了進(jìn)化的大麻素受體如何識(shí)別新配體的機(jī)制基礎(chǔ)。
此研究發(fā)現(xiàn)PYR1衍生的受體可以輕松移植到各種配體反應(yīng)輸出中，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）樣測(cè)定、蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)發(fā)光和轉(zhuǎn)錄電路等，所有這些方法都具有皮摩爾到納摩爾的靈敏度。PYR1為快速發(fā)展的新型生物傳感器提供了一個(gè)支架，可用于各種感測(cè)-反應(yīng)應(yīng)用。
蛋白質(zhì)支架包括細(xì)菌變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子、G蛋白偶聯(lián)受體以及計(jì)算重新設(shè)計(jì)的結(jié)合蛋白。這些技術(shù)已成功地為特定應(yīng)用創(chuàng)建了生物傳感器。然而，這些傳感器的輸出信號(hào)類型受到限制，通常依賴于有限的配體。
而化學(xué)誘導(dǎo)二聚化被引入作為一種吸引人的機(jī)制，用于將傳感與驅(qū)動(dòng)耦合起來(lái)。CID 傳感器依賴于小分子的存在，只有在小分子存在時(shí)，兩種蛋白質(zhì)才能形成穩(wěn)定的異源二聚體。
這種機(jī)制使得CID傳感器在構(gòu)建調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、控制蛋白質(zhì)定位和降解以及調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)方面具有潛力，并且可以構(gòu)建具有模塊化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的傳感器。
植物脫落酸（ABA）傳感系統(tǒng)是一種利用CID機(jī)制的傳感器。其中的一個(gè)示例是擬南芥PYR1-PP2C系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)中，PYR1的配體識(shí)別導(dǎo)致PYR1-配體-蛋白磷酸酶（PP2C）復(fù)合物的形成，從而抑制磷酸酶的活性。
這個(gè)系統(tǒng)的獨(dú)特之處在于配體識(shí)別僅發(fā)生在PYR1內(nèi)部，簡(jiǎn)化了新的CID模塊的工程設(shè)計(jì)。此外，磷酸酶的作用類似于輔助受體，它與PYR1的結(jié)合可以降低配體解離率并顯著增強(qiáng)結(jié)合親和力。
僅需微摩爾級(jí)別的PYR1結(jié)合劑就可以作為納摩爾級(jí)別傳感器與磷酸酶結(jié)合。通過(guò)高密度誘變的方法，可以快速開(kāi)發(fā)出可移植到體內(nèi)外控制系統(tǒng)的感測(cè)-響應(yīng)執(zhí)行器。單獨(dú)的微摩爾 PYR1 結(jié)合劑可以與磷酸酶結(jié)合用作納摩爾傳感器。
在這里，我們利用這些有益的特性擬南芥PYR1-PP2C 系統(tǒng) PYR1-HAB1，用于設(shè)計(jì)用于不同化學(xué)類別的傳感器。我們的數(shù)據(jù)表明，這種支架的高密度誘變能夠快速開(kāi)發(fā)可移植到體外和體內(nèi)控制系統(tǒng)的感覺(jué)-響應(yīng)執(zhí)行器。
為了實(shí)現(xiàn)對(duì)用戶定義分子的高度靈敏和特異的傳感能力，研究人員已經(jīng)從自然界中選擇或設(shè)計(jì)了多種蛋白質(zhì)支架。這些蛋白質(zhì)支架包括細(xì)菌變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子、G蛋白偶聯(lián)受體以及計(jì)算重新設(shè)計(jì)的結(jié)合蛋白等。
它們受到輸出信號(hào)類型的限制（例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)），并且依賴于有限的配體。為了加速生物技術(shù)的發(fā)展，需要開(kāi)發(fā)針對(duì)用戶定義分子的生物傳感器的方法。
化學(xué)誘導(dǎo)二聚化（CID）提供了一種關(guān)鍵的機(jī)制，可以將傳感與驅(qū)動(dòng)耦合起來(lái)。在CID系統(tǒng)中，只有在小分子存在的情況下，兩種蛋白質(zhì)才能形成穩(wěn)定的異源二聚體。
由于CID傳感器依賴于單一蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，因此可以構(gòu)建調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、控制蛋白質(zhì)定位和降解，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的模塊化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。然而，在通常用于傳感的CID系統(tǒng)中，配體結(jié)合在結(jié)合伙伴之間是共享的，這需要重新設(shè)計(jì)整個(gè)界面。
植物脫落酸（ABA）傳感系統(tǒng)利用了自然發(fā)生的CID機(jī)制。其中一個(gè)例子是擬南芥PYR1-PP2C系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，PYR1的配體識(shí)別導(dǎo)致PYR1-配體-蛋白磷酸酶（PP2C）復(fù)合物的形成，從而抑制磷酸酶的活性。
這個(gè)系統(tǒng)的獨(dú)特之處在于配體識(shí)別僅發(fā)生在PYR1內(nèi)部，簡(jiǎn)化了新的CID模塊的工程設(shè)計(jì)。磷酸酶的作用類似于輔助受體，與PYR1結(jié)合會(huì)降低配體解離率并使結(jié)合親和力增強(qiáng)約100倍。
只需微摩爾級(jí)別的PYR1結(jié)合劑就可以作為納摩爾級(jí)別的傳感器與磷酸酶結(jié)合。通過(guò)高密度誘變的方法，可以快速開(kāi)發(fā)出便攜且可移植到體外和體內(nèi)控制系統(tǒng)的感測(cè)-響應(yīng)執(zhí)行器。這種支架的靈活性和適應(yīng)性為生物技術(shù)領(lǐng)域的各個(gè)領(lǐng)域提供了加速發(fā)展的可能性。
這樣看來(lái)化學(xué)誘導(dǎo)二聚化是一種有吸引力的機(jī)制，可以用于設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)靈敏、特異和便攜的生物傳感器，而擬南芥PYR1-PP2C系統(tǒng)則作為一個(gè)有效的蛋白質(zhì)支架在該領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
通過(guò)單點(diǎn)飽和誘變產(chǎn)生的PYR1變體庫(kù)成功分離出可用于調(diào)節(jié)植物脅迫耐受性的農(nóng)用化學(xué)受體。利用結(jié)構(gòu)引導(dǎo)方法，我們預(yù)測(cè)了PYR1的配體結(jié)合口袋中的25個(gè)殘基與ABA密切接觸，這意味著可以通過(guò)組合475種可能的單突變體來(lái)產(chǎn)生108,300種雙突變體。
基于對(duì)保守受體激活機(jī)制的了解，我們移除了六個(gè)位置，并使用Rosetta蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)軟件預(yù)測(cè)了剩余19個(gè)位置的361個(gè)單突變體的穩(wěn)定性糖心vlog在線觀看。這個(gè)分析確定了四個(gè)對(duì)突變特別敏感的位置，限制了最終文庫(kù)中的氨基酸選擇，而其他位置可以突變?yōu)槌腚装彼峄蚋彼嵋酝獾娜魏伟被帷?/p>
經(jīng)過(guò)這些步驟，我們獲得了一個(gè)包含37,797個(gè)單和雙非同義突變體（總共42,743個(gè)突變體）的文庫(kù)。通過(guò)連續(xù)兩輪的單點(diǎn)切口誘變，使用301個(gè)單突變寡核苷酸池構(gòu)建了36,452個(gè)突變體。
而涉及到八個(gè)殘基以內(nèi)的6,291個(gè)突變體無(wú)法使用單突變寡核苷酸組合，因此使用雙突變寡核苷酸池通過(guò)單點(diǎn)切口誘變構(gòu)建。最終，這兩個(gè)文庫(kù)組合形成了用于后續(xù)篩選的雙位點(diǎn)誘變袖珍文庫(kù)（DSM）。DSM文庫(kù)經(jīng)過(guò)深度測(cè)序確認(rèn)含有超過(guò)99.8%所需的雙突變體。
圖 1：基于 PYR1 的高親和力大麻素傳感器的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)引導(dǎo)設(shè)計(jì)。
在研究里我們團(tuán)隊(duì)測(cè)試了幾種高親和力傳感器與同源配體的交叉反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)盡管存在一些交叉反應(yīng)性，但在所有情況下，靶靈敏度至少比脫靶靈敏度高10倍。PYR1衍生的傳感器可以靈敏且選擇性地檢測(cè)配體。
為了了解進(jìn)化的受體識(shí)別大麻素的分子基礎(chǔ)，我們?cè)噲D獲得受體-大麻素-HAB1復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，并針對(duì)兩個(gè)高親和力傳感器PYR1 4F和PYR1 WIN進(jìn)行了研究。
經(jīng)驗(yàn)表明，PYL2比PYR1更容易形成晶體。通過(guò)轉(zhuǎn)置突變，我們成功賦予PYL2對(duì)配體的選擇性反應(yīng)性，生成了PYL2 4F和PYL2 WIN，它們都保留了納摩爾級(jí)的配體反應(yīng)性tangxin。
通過(guò)計(jì)算重新設(shè)計(jì)，我們創(chuàng)建了穩(wěn)定的、催化失活的HAB1衍生物，它具有較高的熱穩(wěn)定性并保持與PYR1的高親和力配體結(jié)合。使用這些工程蛋白質(zhì)進(jìn)行矩陣篩選，我們獲得了三元PYL2的高質(zhì)量晶體，其中包含WIN /WIN 55,212-2/ΔN-HAB1 T+復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
我們還注意到，進(jìn)化的受體可以識(shí)別具有生物活性的(+)-WIN 55,212-2立體異構(gòu)體，盡管選擇時(shí)使用了非手性化合物。天然傳感器識(shí)別ABA的一個(gè)關(guān)鍵特征是形成一個(gè)封閉的受體構(gòu)象異構(gòu)體，該異構(gòu)體由結(jié)構(gòu)保守的水、ABA環(huán)酮、門(mén)和鎖環(huán)中的主鏈酰胺以及HAB1的W385之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定Trp-"鎖定"殘基。
在我們的PYL2 WIN結(jié)構(gòu)中，WIN 55,212-2的萘并吲哚酮功能類似于ABA的酮，并通過(guò)水介導(dǎo)的氫鍵與門(mén)中的主鏈P92、閂鎖中的R120和HAB1的W385鎖殘基形成配位。
下圖表示基于 PYR1 的傳感器可移植到使用 PYR1 WIN演示的各種基于 CID 的輸出系統(tǒng)
再此次研究中我們展示了素受體作為支架的快速生物傳感器的發(fā)展?jié)摿?。通過(guò)測(cè)試多種高親和力傳感器與同源配體的交叉反應(yīng)性，并通過(guò)結(jié)構(gòu)解析獲得受體-配體-催化失活衍生物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，研究人員成功實(shí)現(xiàn)了靈敏和選擇性的配體檢測(cè)。
這項(xiàng)研究為快速生物傳感器的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供了有力的基礎(chǔ)，并為了解進(jìn)化受體識(shí)別機(jī)制以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了重要的分子基礎(chǔ)。這些發(fā)現(xiàn)有望在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域的生物傳感技術(shù)應(yīng)用中發(fā)揮重要作用，為相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供了有益的參考和啟示。
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