編輯：勁哥
文字：勁哥
可用于設計用戶定義的分子生成生物傳感器，為廣泛的生物應用提供檢測工具。此研究利用了一種名為PYR1的植物脫落酸受體，該受體具有可塑的配體結合口袋和配體誘導的異二聚化要求，從而有助于構建有意義的響應函數。
通過這種平臺，我們成功開發了21種傳感器，它們對一系列小分子具有納摩爾到微摩爾的靈敏度，包括結構多樣的天然和合成大麻素以及幾種有機磷酸鹽。通過X射線晶體學分析，我們揭示了進化的大麻素受體如何識別新配體的機制基礎。
此研究發現PYR1衍生的受體可以輕松移植到各種配體反應輸出中，包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）樣測定、蛋白質片段互補發光和轉錄電路等，所有這些方法都具有皮摩爾到納摩爾的靈敏度。PYR1為快速發展的新型生物傳感器提供了一個支架，可用于各種感測-反應應用。
蛋白質支架包括細菌變構轉錄因子、G蛋白偶聯受體以及計算重新設計的結合蛋白。這些技術已成功地為特定應用創建了生物傳感器。然而，這些傳感器的輸出信號類型受到限制，通常依賴于有限的配體。
而化學誘導二聚化被引入作為一種吸引人的機制，用于將傳感與驅動耦合起來。CID 傳感器依賴于小分子的存在，只有在小分子存在時，兩種蛋白質才能形成穩定的異源二聚體。
這種機制使得CID傳感器在構建調節轉錄、控制蛋白質定位和降解以及調節細胞信號傳導方面具有潛力，并且可以構建具有模塊化蛋白質結構的傳感器。
植物脫落酸（ABA）傳感系統是一種利用CID機制的傳感器。其中的一個示例是擬南芥PYR1-PP2C系統。在這個系統中，PYR1的配體識別導致PYR1-配體-蛋白磷酸酶（PP2C）復合物的形成，從而抑制磷酸酶的活性。
這個系統的獨特之處在于配體識別僅發生在PYR1內部，簡化了新的CID模塊的工程設計。此外，磷酸酶的作用類似于輔助受體，它與PYR1的結合可以降低配體解離率并顯著增強結合親和力。
僅需微摩爾級別的PYR1結合劑就可以作為納摩爾級別傳感器與磷酸酶結合。通過高密度誘變的方法，可以快速開發出可移植到體內外控制系統的感測-響應執行器。單獨的微摩爾 PYR1 結合劑可以與磷酸酶結合用作納摩爾傳感器。
在這里，我們利用這些有益的特性擬南芥PYR1-PP2C 系統 PYR1-HAB1，用于設計用于不同化學類別的傳感器。我們的數據表明，這種支架的高密度誘變能夠快速開發可移植到體外和體內控制系統的感覺-響應執行器。
為了實現對用戶定義分子的高度靈敏和特異的傳感能力，研究人員已經從自然界中選擇或設計了多種蛋白質支架。這些蛋白質支架包括細菌變構轉錄因子、G蛋白偶聯受體以及計算重新設計的結合蛋白等。
它們受到輸出信號類型的限制（例如轉錄調節），并且依賴于有限的配體。為了加速生物技術的發展，需要開發針對用戶定義分子的生物傳感器的方法。
化學誘導二聚化（CID）提供了一種關鍵的機制，可以將傳感與驅動耦合起來。在CID系統中，只有在小分子存在的情況下，兩種蛋白質才能形成穩定的異源二聚體。
由于CID傳感器依賴于單一蛋白質-蛋白質相互作用，因此可以構建調節轉錄、控制蛋白質定位和降解，以及調節細胞信號傳導的模塊化蛋白質結構。然而，在通常用于傳感的CID系統中，配體結合在結合伙伴之間是共享的，這需要重新設計整個界面。
植物脫落酸（ABA）傳感系統利用了自然發生的CID機制。其中一個例子是擬南芥PYR1-PP2C系統。在該系統中，PYR1的配體識別導致PYR1-配體-蛋白磷酸酶（PP2C）復合物的形成，從而抑制磷酸酶的活性。
這個系統的獨特之處在于配體識別僅發生在PYR1內部，簡化了新的CID模塊的工程設計。磷酸酶的作用類似于輔助受體，與PYR1結合會降低配體解離率并使結合親和力增強約100倍。
只需微摩爾級別的PYR1結合劑就可以作為納摩爾級別的傳感器與磷酸酶結合。通過高密度誘變的方法，可以快速開發出便攜且可移植到體外和體內控制系統的感測-響應執行器。這種支架的靈活性和適應性為生物技術領域的各個領域提供了加速發展的可能性。
這樣看來化學誘導二聚化是一種有吸引力的機制，可以用于設計設計靈敏、特異和便攜的生物傳感器，而擬南芥PYR1-PP2C系統則作為一個有效的蛋白質支架在該領域具有廣泛的應用前景。
通過單點飽和誘變產生的PYR1變體庫成功分離出可用于調節植物脅迫耐受性的農用化學受體。利用結構引導方法，我們預測了PYR1的配體結合口袋中的25個殘基與ABA密切接觸，這意味著可以通過組合475種可能的單突變體來產生108,300種雙突變體。
基于對保守受體激活機制的了解，我們移除了六個位置，并使用Rosetta蛋白質設計軟件預測了剩余19個位置的361個單突變體的穩定性糖心vlog在線觀看。這個分析確定了四個對突變特別敏感的位置，限制了最終文庫中的氨基酸選擇，而其他位置可以突變為除半胱氨酸或脯氨酸以外的任何氨基酸。
經過這些步驟，我們獲得了一個包含37,797個單和雙非同義突變體（總共42,743個突變體）的文庫。通過連續兩輪的單點切口誘變，使用301個單突變寡核苷酸池構建了36,452個突變體。
而涉及到八個殘基以內的6,291個突變體無法使用單突變寡核苷酸組合，因此使用雙突變寡核苷酸池通過單點切口誘變構建。最終，這兩個文庫組合形成了用于后續篩選的雙位點誘變袖珍文庫（DSM）。DSM文庫經過深度測序確認含有超過99.8%所需的雙突變體。
圖 1：基于 PYR1 的高親和力大麻素傳感器的蛋白質結構引導設計。
在研究里我們團隊測試了幾種高親和力傳感器與同源配體的交叉反應性，發現盡管存在一些交叉反應性，但在所有情況下，靶靈敏度至少比脫靶靈敏度高10倍。PYR1衍生的傳感器可以靈敏且選擇性地檢測配體。
為了了解進化的受體識別大麻素的分子基礎，我們試圖獲得受體-大麻素-HAB1復合物的結構，并針對兩個高親和力傳感器PYR1 4F和PYR1 WIN進行了研究。
經驗表明，PYL2比PYR1更容易形成晶體。通過轉置突變，我們成功賦予PYL2對配體的選擇性反應性，生成了PYL2 4F和PYL2 WIN，它們都保留了納摩爾級的配體反應性tangxin。
通過計算重新設計，我們創建了穩定的、催化失活的HAB1衍生物，它具有較高的熱穩定性并保持與PYR1的高親和力配體結合。使用這些工程蛋白質進行矩陣篩選，我們獲得了三元PYL2的高質量晶體，其中包含WIN /WIN 55,212-2/ΔN-HAB1 T+復合物的結構。
我們還注意到，進化的受體可以識別具有生物活性的(+)-WIN 55,212-2立體異構體，盡管選擇時使用了非手性化合物。天然傳感器識別ABA的一個關鍵特征是形成一個封閉的受體構象異構體，該異構體由結構保守的水、ABA環酮、門和鎖環中的主鏈酰胺以及HAB1的W385之間的氫鍵網絡穩定Trp-"鎖定"殘基。
在我們的PYL2 WIN結構中，WIN 55,212-2的萘并吲哚酮功能類似于ABA的酮，并通過水介導的氫鍵與門中的主鏈P92、閂鎖中的R120和HAB1的W385鎖殘基形成配位。
下圖表示基于 PYR1 的傳感器可移植到使用 PYR1 WIN演示的各種基于 CID 的輸出系統
再此次研究中我們展示了素受體作為支架的快速生物傳感器的發展潛力。通過測試多種高親和力傳感器與同源配體的交叉反應性，并通過結構解析獲得受體-配體-催化失活衍生物復合物的結構，研究人員成功實現了靈敏和選擇性的配體檢測。
這項研究為快速生物傳感器的設計和開發提供了有力的基礎，并為了解進化受體識別機制以及植物激素信號轉導提供了重要的分子基礎。這些發現有望在醫藥、農業和環境領域的生物傳感技術應用中發揮重要作用，為相關領域的研究和應用提供了有益的參考和啟示。
Glasgow, A. A. 《模塊化蛋白質感覺反應系統的計算設計》 1024–1028 (2019)
Taylor, N. D.《工程一個異構轉錄因子以響應新的配體》在《自然方法》所發表的論文，177-183（2016）
Tinberg, C. E.。《具有高親和力和選擇性的配體結合蛋白的計算設計》。在《自然501》所發布 212-216（2013）。
tangxin 糖心vlog入口